Химичен синтез на ДНК

Понастоящем изкуствени фрагменти от нуклеинови киселини с различна дължина и всякакъв състав могат да бъдат синтезирани доста бързо (такива фрагменти се наричат олигонуклеотиди), и след това ги комбинирайте в по-дълги вериги с помощта на специални ензими. Получените по този начин гени и техните фрагменти се използват широко в генното инженерство, биотехнологиите, а също и за диагностика на инфекциозни и генетични заболявания. Така че могат да се използват химически синтезирани олигонуклеотиди:

За изграждане на цели гени или техни фрагменти

За амплификация на специфични ДНК фрагменти

За насочени мутации на изолирана ДНК

Като сонди за хибридизация

Като линкери за улесняване на клонирането.

Припомнете си, че нуклеиновите киселини са неправилни биополимери, състоящи се от мономерни структури - нуклеотиди (фиг. 29).

Ориз. 29. Състав и структура на нуклеотида.

По този начин:

Нуклеотид \u003d нуклеозид + фосфорна киселина \u003d азотна основа + пентоза + фосфорна киселина.

В РНК пентозата е рибоза. ДНК съдържа дезоксирибоза.

Съставът на нуклеиновите киселини и олигонуклеотидите включва пет нуклеотида, които се различават един от друг в структурата на азотния хетероцикъл. Три от тях - производни на аденин (A), гуанин (G) и цитозин (C) са включени както в ДНК, така и в РНК, тимин (Т) - само в ДНК, урацил (U) - само в РНК. Нуклеотидите, за разлика от нуклеозидите, съдържат остатък от фосфорна киселина. Нуклеотидите са свързани помежду си в полимерна верига с помощта на фосфодиестерни връзки (фиг. 30). Азотните бази не участват в свързването на нуклеотидите на една верига.

Ориз. 30. Схема на свързване на нуклеотиди с помощта на фосфодиестерна връзка

Задачата на химичния синтез на нуклеиновите киселини е съчетаването на съставните им мономери в строго определена последователност. За образуването на междунуклеотидна връзка два нуклеотида трябва да бъдат свързани с елиминирането на водна молекула. Полученият димер след това реагира със следващия мономер (нуклеотид), за да образува тример и т.н. За да се осъществят тези реакции, трябва да бъдат изпълнени следните условия.

1. Необходимо е да се постигне селективност на свързването на мономерни единици. Например хидроксилната група на първия нуклеотид трябва да взаимодейства с фосфатния остатък на втория, но не и обратното, т.к. един от принципите на изграждане на полинуклеотидите в природата е еднополярността, т.е. мономерно съединение винаги в посока 5" → 3" . За тази цел фрагментите, които не участват в реакцията, трябва да бъдат блокирани с помощта на специални защитни групи.

2. Сами по себе си хидроксилните и фосфатните групи в нуклеотидите не реагират помежду си. За да се извърши кондензацията на мономерите, е необходимо да се активира фосфатната група.

3. Тъй като синтезът се извършва на няколко етапа, всяка реакция трябва да протича с много висок добив.

4. Всички процеси - въвеждане и отстраняване на защитни групи, активиране и кондензация - трябва да се извършват при меки условия, т.е. без използване на високи температури, както и концентрирани разтвори на киселини или основи, които биха могли да доведат до образуване на странични продукти и разрушаване на съществуващи и новообразувани химични връзки.

Понастоящем са разработени голям брой методи за синтез на олигонуклеотиди, които отговарят на тези условия, избрани са удобни защитни групи и са предложени методи за активиране на фосфатната група.

Синтезът на разширени фрагменти от нуклеинови киселини се състои от голям брой етапи. След провеждане на всяка химическа реакция е необходимо да се изолира полученият продукт, пречиствайки го от нереагирали изходни материали и други примеси. Това прави процеса дълъг и трудоемък, а също така води до значителни загуби на всеки етап от изолацията.

Американският учен Робърт Мерифийлд през 1962 г. предложи оригиналната идея за метод за синтез на твърда фаза, което направи възможно драстично опростяване и ускоряване на процеса. Идеята е, че първият мономер (нуклеозид) е прикрепен към неразтворим полимерен носител (твърда фаза), който се поставя в колона на реактор. През колоната се пропуска разтвор, съдържащ втория мономер и други необходими реагенти. В този случай полученият реакционен продукт също се оказва прикрепен към твърдата фаза. След това колоната се промива с разтворител, за да се отстранят нереагиралите вещества и странични продукти, след което следващият мономер се пропуска през реактора, като процедурата се повтаря многократно, докато завърши синтезата на желания продукт. По този начин нарастващата полимерна верига се фиксира върху твърдата фаза по време на синтеза и всички реакции с други компоненти в разтвора протичат върху опорната повърхност. Тази техника дава възможност да се заменят сложните и отнемащи време процедури за отделяне и пречистване на междинните продукти с елементарни операции по измиване на полимери.

Синтезът включва няколко основни етапа.

Етап 1. Получаване на защитени мономери, които са изходни блокове за изграждане на олигонуклеотидна верига. За да направите това, онези фрагменти от молекули, които не трябва да претърпяват химически трансформации, се блокират със специални защитни групи.

Стъпка 2: Прикрепване на крайния мономер (защитен нуклеозид) към полимерния носител. Гранулите носител с прикрепен краен мономер се въвеждат в колоната на реактора.

Стъпка 3: Премахване на защитата на крайния мономер. За да направите това, разтвор на реагент преминава през колоната, причинявайки елиминиране на защитната група.

Етап 4. Кондензация, за която през колоната се пропуска разтвор на втория мономер, смесен с активиращ реагент.

Стъпки 3 и 4 се повтарят многократно, докато се получи биополимер с необходимата дължина. След това се изпълняват стъпки 5 и 6.

Етап 5. Обработка на носителя с реагенти, водещи до отцепване на синтезирания продукт от твърдата фаза и отстраняване на всички защитни групи.

Етап 6. Изолиране и пречистване на синтезирания фрагмент от нуклеинова киселина чрез различни хроматографски и електрофоретични методи. (Поради непълнотата на реакциите, по-късите верижни фрагменти се натрупват върху подложката към края на синтеза, така че е необходимо цялостно пречистване на крайния продукт).

Основният принос за развитието на синтеза на олигонуклеотиди е направен от G. Korana, който в началото на 60-те години извършва химичен синтез на фрагменти от нуклеинова киселина с дадена последователност и получава Нобелова награда за тази работа през 1968 г. През 1970 г. той за първи път синтезира пълния ген за трансфер на аланин РНК.

През 1975 г. R. Letsinger предложи нов метод за образуване на междунуклеотидна връзка, въз основа на който в началото на 80-те години M. Carruthers разработи така наречения твърдофазен амидофосфитен или фосфорамидитен метод за синтез на олигонуклеотиди. Оттогава започва бързото развитие на този метод и неговата автоматизация.

Първоначалните градивни елементи за синтеза на олигонуклеотид са модифицирани дезоксирибонуклеозиди (амидофосфити или фосфорамидити). Тези съединения, съдържащи тривалентен фосфор, са по-активни от производните на петвалентния фосфор (фиг. 31).

Амидофосфитните мономери се получават от защитени нуклеозиди. Модификацията се състои в свързване на бензенова група към аминогрупите на дезоксиаденозин и дезоксицидин и изобутиралова група към аминогрупата на деоксигуанозин. Тимидинът, който няма аминогрупа, не е модифициран. Тази модификация е необходима за защита на нуклеозидите от нежелани странични ефекти.

Ориз. 31. Структурна формула на фосфорамидита

Такива производни на четирите бази - A, T, G и C се използват за химичния синтез на ДНК.

DMT - диметокситритил

Me - метилова група

Синтезът се извършва в твърда фаза, растящата ДНК верига е фиксирана върху твърд носител, което прави възможно провеждането на всички реакции в един контейнер, лесно измиване на ненужните реагенти след всеки етап и добавяне на нови в количество, оптимално за пълната реакция. Първият нуклеозид е фиксиран към твърда подложка чрез химикал дистанционер(Фигура 32). Това обикновено са порести стъклени перли с пори с еднакъв размер.

Ориз. 32. Първият нуклеозид, фиксиран с спейсър.

След n цикъла, извършени съгласно схемата на синтез (фиг. 33), се образува едноверижен ДНК фрагмент от n + 1 нуклеотид

Ориз. 33. Схема на химичен синтез на олигонуклеотид

Цикълът започва след прикрепването на първия нуклеозид към стъклената перла

Промива се с безводен разтворител (ацетонитрил), остатъците от който се отстраняват чрез продухване с аргон

Промит с TCA (трихлороцетна киселина) за отстраняване на DMT (детритилиране)

Отново се промива с разтворител и TCA, продухва се с аргон и на този етап се въвежда следващият нуклеозид под формата на фосфоримидит и тетразол, който активира фосфорамидита, несвързаните реагенти се отстраняват чрез продухване с аргон.

Тъй като в края на първия етап не всички поддържани нуклеозиди са свързани с фосфорамидита, е необходимо да се предотврати тяхното взаимодействие с нуклеозида, добавен във втория етап. За да се направи това, нереагиралата 5'-OH група се ацетилира с оцетен анхидрид и диметиламинопиридин (затваряне).

Нестабилната фосфитна триестерна връзка, образувана във втория етап между нуклеотидите, се окислява с йодна смес до петавалентен фосфатен триестер.

Всички описани операции се извършват до добавяне на последния нуклеозид към нарастващата верига в съответствие с програмата.

Метиловите групи се отстраняват чрез химична обработка директно в реакционната колона. След това олигонуклеотидите се отделят от спейсерната молекула заедно с 3'-ОН края и се елуират от колоната; след това бензоилната, изобутиралната и DMT групите се отстраняват последователно. 5'-краят на веригата се фосфорилира чрез ензимен (полинуклеотид киназа + АТФ) или химичен метод

Важно предимство на метода на твърдофазен синтез е простотата на операциите. Процесът на синтез се състои от повтарящи се стъпки на преминаване на защитените мономери, реагенти и разтворители през колона с полимерен носител, към който е прикрепена нарастваща верига. Това дава възможност за автоматизиране на процеса.

Автоматичните синтезатори включват реактор, съдържащ носител с първи мономер, прикрепен към него, и съдове с необходимите мономери, реагенти и разтворители. С помощта на помпа разтворите от тези съдове се подават последователно в реактора в съответствие с наличната програма и зададената последователност на синтезирания протеин или фрагмент от нуклеинова киселина. В момента автоматичните синтезатори на пептиди и олигонуклеотиди се произвеждат от различни компании, включително местни.

ДНК секвениране

Изчерпателна информация за една ДНК молекула може да се получи само чрез определяне на нейната нуклеотидна последователност. Тази процедура се нарича секвениране(от английски. последователност). Така, чрез секвениране на гена, т.е. след установяване на нуклеотидната последователност на определен участък от ДНК, често е възможно да се установи нейната функция чрез сравняване на тази нуклеотидна последователност с тези за гени, чиято функция вече е известна. Без данни за нуклеотидната последователност е невъзможно да се проведат изследвания върху молекулярното клониране, както и създаването на експресионна рекомбинантна ДНК.

Секвенирането на ДНК е доста скъпо. Те изискват специално прецизно оборудване, свръхчисти химикали и биологични препарати, както и висококвалифицирани специалисти. Потенциалът на биотехнологията ще бъде напълно реализиран само когато нейните инструменти (включително секвениране на генома) станат толкова достъпни и евтини, колкото персоналните компютри. За да намалят цената на процедурата за секвениране, разработчиците на нови методи се опитват да намалят броя на подготвителните стъпки, да миниатюризират оборудването до краен предел и да секвенират милиони молекули едновременно.

Преди да се пристъпи към описанието на методите за секвениране, е необходимо да се припомнят основните точки на възпроизвеждане на ДНК нуклеотидни последователности, т.е. някои основни стъпки на репликация на ДНК.

ДНК на клетка, която започва да се дели, претърпява кардинални промени: двойната спирала се развива, веригите се разминават. На всяка верига започва синтезът на комплементарни полинуклеотиди, на една - непрекъсната, на втората - прекъсната. Катализира се от ензим, наречен ДНК-зависима ДНК полимераза; друг ензим, ДНК лигаза, свързва полинуклеотидните фрагменти в непрекъсната верига. Така от една ДНК молекула се образуват две.

Много методи за секвениране на ДНК се основават на взаимното допълване на веригите на тази молекула. Генетичната азбука се състои само от четири букви – азотните основи на аденин (А), цитозин (С), гуанин (G) и тимин (Т). Базите на противоположните вериги на ДНК молекулата са свързани в съответствие с правилото за комплементарност: A образува двойка с T, а C с G. В резултат на това взаимодействие се образува добре известната двойна спирала - a структура, наподобяваща вита стълба (фиг. 34).

Ориз. 34. Схема за синтез на дъщерни нуклеотидни вериги на двете ДНК вериги

Живите организми използват принципа на комплементарност, за да копират своя генетичен материал (репликация) и да поправят щетите върху него (поправка). Той също така е в основата на амплификацията (вижте PCR) на целевите ДНК фрагменти и тяхното последващо секвениране с помощта на метод, разработен в края на 70-те години. Ф. Сангер.