Síntesis química del ADN

En la actualidad, los fragmentos artificiales de ácidos nucleicos de diferentes longitudes y cualquier composición se pueden sintetizar con bastante rapidez (dichos fragmentos se denominan oligonucleótidos), y luego combinarlos en cadenas más largas usando enzimas especiales. Los genes y sus fragmentos así obtenidos se utilizan ampliamente en ingeniería genética, biotecnología y también para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y genéticas. Entonces se pueden usar oligonucleótidos sintetizados químicamente:

Para la construcción de genes completos o sus fragmentos

Para la amplificación de fragmentos de ADN específicos

Para mutaciones dirigidas de ADN aislado

Como sondas para hibridación.

Como enlazadores para facilitar la clonación.

Recuerde que los ácidos nucleicos son biopolímeros irregulares que consisten en estructuras monoméricas: nucleótidos (Fig. 29).

Arroz. 29. Composición y estructura del nucleótido.

De este modo:

Nucleótido \u003d nucleósido + ácido fosfórico \u003d base nitrogenada + pentosa + ácido fosfórico.

En el ARN, la pentosa es ribosa. El ADN contiene desoxirribosa.

La composición de ácidos nucleicos y oligonucleótidos incluye cinco nucleótidos que difieren entre sí en la estructura del heterociclo nitrogenado. Tres de ellos: los derivados de adenina (A), guanina (G) y citosina (C) están incluidos tanto en el ADN como en el ARN, la timina (T), solo en el ADN, el uracilo (U), solo en el ARN. Los nucleótidos, a diferencia de los nucleósidos, contienen un residuo de ácido fosfórico. Los nucleótidos están conectados entre sí en una cadena polimérica mediante enlaces fosfodiéster (Fig. 30). Las bases nitrogenadas no toman parte en la unión de los nucleótidos de una cadena.

Arroz. 30. Esquema de conexión de nucleótidos mediante un enlace fosfodiéster

La tarea de la síntesis química de ácidos nucleicos es la combinación de sus monómeros constituyentes en una secuencia estrictamente definida. Para la formación de un enlace internucleotídico, dos nucleótidos deben estar conectados con la eliminación de una molécula de agua. El dímero resultante luego reacciona con el siguiente monómero (nucleótido) para formar un trímero, y así sucesivamente. Para que estas reacciones se lleven a cabo, se deben cumplir las siguientes condiciones.

1. Es necesario lograr la selectividad de la conexión de unidades monoméricas. Por ejemplo, el grupo hidroxilo del primer nucleótido debería interactuar con el residuo fosfato del segundo, pero no al revés, porque uno de los principios de la construcción de polinucleótidos en la naturaleza es la unipolaridad, es decir, compuesto monómero siempre en dirección 5" → 3" . Para ello, los fragmentos que no participen en la reacción deben bloquearse mediante grupos protectores especiales.

2. Por sí mismos, los grupos hidroxilo y fosfato de los nucleótidos no reaccionan entre sí. Para llevar a cabo la condensación de los monómeros es necesario activar el grupo fosfato.

3. Dado que la síntesis se lleva a cabo en varias etapas, cada reacción debe proceder con un rendimiento muy alto.

4. Todos los procesos -la introducción y eliminación de grupos protectores, la activación y la condensación- deben realizarse en condiciones suaves, es decir, sin el uso de altas temperaturas, así como soluciones concentradas de ácidos o álcalis, que podrían conducir a la formación de subproductos y la destrucción de enlaces químicos existentes y recién formados.

En la actualidad se han desarrollado un gran número de métodos para la síntesis de oligonucleótidos que satisfacen estas condiciones, se han seleccionado grupos protectores convenientes y se han propuesto métodos para activar el grupo fosfato.

La síntesis de fragmentos extendidos de ácidos nucleicos consta de un gran número de etapas. Después de llevar a cabo cada reacción química, es necesario aislar el producto resultante, purificándolo de materiales de partida sin reaccionar y otras impurezas. Esto hace que el proceso sea largo y laborioso, y también genera pérdidas significativas en cada etapa del aislamiento.

El científico estadounidense Robert Merrifield en 1962 propuso la idea original de un método de síntesis en fase sólida, que permitió simplificar y acelerar drásticamente el proceso. La idea es que el primer monómero (nucleósido) se une a un soporte de polímero insoluble (fase sólida) que se coloca en una columna del reactor. Se pasa a través de la columna una solución que contiene el segundo monómero y otros reactivos necesarios. En este caso, el producto de reacción resultante también resulta estar unido a la fase sólida. Luego, la columna se lava con solvente para eliminar las sustancias que no reaccionaron y los subproductos, después de lo cual se pasa el siguiente monómero a través del reactor, repitiendo el procedimiento muchas veces hasta que se completa la síntesis del producto deseado. Por lo tanto, la cadena de polímero en crecimiento se fija en la fase sólida durante la síntesis, y todas las reacciones con otros componentes en solución tienen lugar en la superficie del soporte. Esta técnica hace posible reemplazar procedimientos complejos y lentos para separar y purificar productos intermedios con operaciones elementales de lavado de polímeros.

La síntesis incluye varios pasos fundamentales.

Etapa 1. Obtención de monómeros protegidos, que son los bloques de partida para la construcción de una cadena de oligonucleótidos. Para ello, aquellos fragmentos de moléculas que no deberían sufrir transformaciones químicas se bloquean con grupos protectores especiales.

Paso 2: Unión del monómero terminal (nucleósido protegido) al soporte polimérico. Los gránulos portadores con el monómero terminal unido se introducen en la columna del reactor.

Paso 3: Desprotección del monómero terminal. Para ello se hace pasar por la columna una solución de un reactivo, provocando la eliminación del grupo protector.

Etapa 4. Condensación, para lo cual se pasa por la columna una solución del segundo monómero mezclada con un reactivo activador.

Los pasos 3 y 4 se repiten muchas veces hasta obtener un biopolímero de la longitud requerida. Luego se realizan los pasos 5 y 6.

Etapa 5. Tratamiento del soporte con reactivos que conducen a la escisión del producto sintetizado de la fase sólida y la eliminación de todos los grupos protectores.

Etapa 6. Aislamiento y purificación del fragmento de ácido nucleico sintetizado mediante diversos métodos cromatográficos y electroforéticos. (Debido a que las reacciones son incompletas, los fragmentos de cadenas más cortas se acumulan en el soporte hacia el final de la síntesis, por lo que es necesaria una purificación completa del producto final).

La principal contribución al desarrollo de la síntesis de oligonucleótidos la realizó G. Korana, quien a principios de los años 60 llevó a cabo la síntesis química de fragmentos de ácido nucleico de una secuencia dada y recibió el Premio Nobel por este trabajo en 1968. En 1970, sintetizó por primera vez el gen completo del ARN de transferencia de alanina.

En 1975, R. Letsinger propuso un nuevo método para la formación de un enlace entre nucleótidos, en base al cual, a principios de los años 80, M. Carruthers desarrolló el llamado método de amidofosfito o fosforamidita en fase sólida para la síntesis de oligonucleótidos. Desde ese momento, comenzó el rápido desarrollo de este método y su automatización.

Los componentes básicos iniciales para la síntesis de un oligonucleótido son los desoxirribonucleósidos modificados (amidofosfitos o fosforamiditos). Estos compuestos que contienen fósforo trivalente son más activos que los derivados del fósforo pentavalente (Fig. 31).

Los monómeros de amidofosfito se derivan de nucleósidos protegidos. La modificación consiste en unir un grupo benceno a los grupos amino de la desoxiadenosina y la desoxicidina, y un grupo isobutiral al grupo amino de la desoxiguanosina. La timidina, que carece de un grupo amino, no se modifica. Esta modificación es necesaria para proteger los nucleósidos de efectos secundarios no deseados.

Arroz. 31. Fórmula estructural de fosforamidita

Dichos derivados de las cuatro bases: A, T, G y C se utilizan para la síntesis química del ADN.

DMT - dimetoxitritilo

Me - grupo metilo

La síntesis se lleva a cabo en fase sólida, la cadena de ADN en crecimiento se fija en un soporte sólido, lo que hace posible llevar a cabo todas las reacciones en un solo recipiente, lavar fácilmente los reactivos innecesarios después de cada etapa y agregar nuevos en una cantidad óptima para la reacción completa. El primer nucleósido se fija a un soporte sólido por medios químicos. espaciador(Figura 32). Suelen ser perlas de vidrio poroso con poros del mismo tamaño.

Arroz. 32. El primer nucleósido fijado con un espaciador.

Después de n ciclos llevados a cabo de acuerdo con el esquema de síntesis (Fig. 33), se forma un fragmento de ADN monocatenario a partir de n + 1 nucleótido

Arroz. 33. Esquema de síntesis química de un oligonucleótido.

El ciclo comienza después de la unión del primer nucleósido a la perla de vidrio.

Lavado con un disolvente anhidro (acetonitrilo), cuyos restos se eliminan por purga con argón

Lavado con TCA (ácido tricloroacético) para eliminar DMT (destritilación)

Se vuelve a lavar con disolvente y TCA, se purga con argón, y en esta etapa se introduce el siguiente nucleósido en forma de fosforimidita y tetrazol, que activa la fosforamidita, los reactivos no unidos se eliminan purgando con argón.

Dado que, al final del primer paso, no todos los nucleósidos soportados están unidos a la fosforamidita, es necesario evitar su interacción con el nucleósido añadido en el segundo paso. Para ello, el grupo 5'-OH que no ha reaccionado se acetila con anhídrido acético y dimetilaminopiridina (remate).

El enlace triéster de fosfito inestable formado en el segundo paso entre los nucleótidos se oxida con una mezcla de yodo a un triéster de fosfato pentavalente.

Todas las operaciones descritas se llevan a cabo hasta que se añade el último nucleósido a la cadena de crecimiento de acuerdo con el programa.

Los grupos metilo se eliminan mediante tratamiento químico directamente en la columna de reacción. Luego, los oligonucleótidos se separan de la molécula espaciadora junto con el extremo 3'-OH y se eluyen de la columna; luego se eliminan secuencialmente los grupos benzoílo, isobutiral y DMT. El extremo 5' de la cadena se fosforila por método enzimático (polinucleótido quinasa + ATP) o químico

Una ventaja importante del método de síntesis en fase sólida es la simplicidad de las operaciones. El proceso de síntesis consiste en pasos repetidos de pasar los monómeros, reactivos y solventes protegidos a través de una columna con un soporte de polímero al que se une una cadena en crecimiento. Esto permite automatizar el proceso.

Los sintetizadores automáticos incluyen un reactor que contiene un vehículo con un primer monómero adjunto y recipientes con los monómeros, reactivos y disolventes necesarios. Con la ayuda de una bomba, las soluciones de estos recipientes se introducen alternativamente en el reactor de acuerdo con el programa disponible y la secuencia dada del fragmento de proteína o ácido nucleico que se está sintetizando. Actualmente, varias empresas, incluidas las nacionales, producen sintetizadores automáticos de péptidos y oligonucleótidos.

secuencia ADN

La información completa sobre una molécula de ADN solo se puede obtener determinando su secuencia de nucleótidos. Este procedimiento se llama secuenciación(De inglés. secuencia). Por lo tanto, mediante la secuenciación del gen, es decir, habiendo establecido la secuencia de nucleótidos de una cierta sección de ADN, a menudo es posible establecer su función comparando esta secuencia de nucleótidos con aquellas de genes cuya función ya se conoce. Sin datos sobre la secuencia de nucleótidos, es imposible realizar investigaciones sobre clonación molecular, así como la creación de ADN recombinante de expresión.

La secuenciación del ADN es bastante costosa. Requieren equipos especiales de precisión, productos químicos ultrapuros y preparaciones biológicas, así como especialistas altamente capacitados. El potencial de la biotecnología solo se realizará plenamente cuando sus herramientas (incluida la secuenciación del genoma) sean tan accesibles y económicas como las computadoras personales. Para reducir el costo del procedimiento de secuenciación, los desarrolladores de nuevos métodos están tratando de reducir la cantidad de pasos preparatorios, miniaturizar el equipo al límite y secuenciar millones de moléculas simultáneamente.

Antes de proceder a la descripción de los métodos de secuenciación, es necesario recordar los principales puntos de reproducción de las secuencias de nucleótidos de ADN, es decir. algunos pasos fundamentales de la replicación del ADN.

El ADN de una célula que comienza a dividirse sufre cambios cardinales: la doble hélice se desenrolla, las cadenas divergen. En cada cadena, comienza la síntesis de polinucleótidos complementarios, en uno, continuo, en el segundo, discontinuo. Es catalizada por una enzima llamada ADN polimerasa dependiente de ADN; otra enzima, la ADN ligasa, une fragmentos de polinucleótidos en una cadena continua. Así que de una molécula de ADN se forman dos.

Muchos métodos de secuenciación del ADN se basan en la complementariedad mutua de las cadenas de esta molécula. El alfabeto genético consta de solo cuatro letras: las bases nitrogenadas de adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). Las bases de las hebras opuestas de la molécula de ADN están conectadas de acuerdo con la regla de la complementariedad: A forma un par con T y C con G. Como resultado de esta interacción, se forma la conocida doble hélice: un estructura que se asemeja a una escalera de caracol (Fig. 34).

Arroz. 34. Esquema para la síntesis de cadenas de nucleótidos hijas en ambas cadenas de ADN

Los organismos vivos utilizan el principio de complementariedad para copiar su material genético (replicación) y reparar el daño (reparación). También es la base de la amplificación (ver PCR) de fragmentos de ADN objetivo y su posterior secuenciación mediante un método desarrollado a fines de la década de 1970. F. Sanger.