DNA'nın kimyasal sentezi

Şu anda, farklı uzunluklardaki ve herhangi bir bileşimdeki nükleik asitlerin yapay fragmanları oldukça hızlı bir şekilde sentezlenebilir (bu tür fragmanlara denir. oligonükleotidler) ve daha sonra özel enzimler kullanarak daha uzun zincirler halinde birleştirin. Bu şekilde elde edilen genler ve fragmanları, genetik mühendisliğinde, biyoteknolojide ve ayrıca bulaşıcı ve genetik hastalıkların teşhisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Böylece kimyasal olarak sentezlenmiş oligonükleotidler kullanılabilir:

Bütün genlerin veya bunların parçalarının inşası için

Spesifik DNA fragmanlarının amplifikasyonu için

İzole DNA'nın yönlendirilmiş mutasyonları için

Hibridizasyon için problar olarak

Klonlamayı kolaylaştırmak için bağlayıcılar olarak.

Nükleik asitlerin, monomerik yapılardan - nükleotitlerden oluşan düzensiz biyopolimerler olduğunu hatırlayın (Şekil 29).

Pirinç. 29. Nükleotidin bileşimi ve yapısı.

Böylece:

Nükleotit \u003d nükleosit + fosforik asit \u003d azotlu baz + pentoz + fosforik asit.

RNA'da pentoz ribozdur. DNA deoksiriboz içerir.

Nükleik asitlerin ve oligonükleotitlerin bileşimi, nitrojen heterosikl yapısında birbirinden farklı beş nükleotit içerir. Bunlardan üçü - adenin (A), guanin (G) ve sitozin (C) türevleri hem DNA'da hem de RNA'da, timin (T) - yalnızca DNA'da, urasil (U) - yalnızca RNA'da bulunur. Nükleotitler, nükleositlerin aksine, bir fosforik asit kalıntısı içerir. Nükleotitler, fosfodiester bağları kullanılarak bir polimer zincirinde birbirine bağlanır (Şekil 30). Azotlu bazlar, bir zincirin nükleotitlerinin bağlantısında yer almaz.

Pirinç. 30. Bir fosfodiester bağı kullanarak nükleotitleri bağlama şeması

Nükleik asitlerin kimyasal sentezinin görevi, onları oluşturan monomerlerin kesin olarak tanımlanmış bir dizide kombinasyonudur. Bir nükleotidler arası bağın oluşması için, bir su molekülünün ortadan kaldırılmasıyla iki nükleotid bağlanmalıdır. Ortaya çıkan dimer daha sonra bir sonraki monomer (nükleotit) ile reaksiyona girerek bir trimer oluşturur ve bu böyle devam eder. Bu reaksiyonların gerçekleşmesi için aşağıdaki şartların sağlanması gerekir.

1. Monomer birimlerinin bağlantısının seçiciliğini sağlamak gereklidir. Örneğin, birinci nükleotidin hidroksil grubu, ikinci nükleotidin fosfat kalıntısı ile etkileşime girmelidir, ancak tersi olmamalıdır, çünkü Doğada polinükleotit oluşturma ilkelerinden biri tek kutupluluktur, yani monomer bileşik her zaman 5" → 3" yönünde . Bunun için reaksiyona katılmayan fragmanların özel koruyucu gruplar kullanılarak bloke edilmesi gerekir.

2. Nükleotitlerdeki hidroksil ve fosfat grupları kendi başlarına birbirleriyle reaksiyona girmezler. Monomerlerin yoğunlaşmasını gerçekleştirmek için fosfat grubunu aktive etmek gerekir.

3. Sentez birkaç aşamada gerçekleştirildiğinden, her reaksiyonun çok yüksek verimle ilerlemesi gerekir.

4. Tüm işlemler - koruyucu grupların eklenmesi ve çıkarılması, aktivasyon ve yoğuşma - ılımlı koşullar altında, yani yüksek sıcaklıkların yanı sıra konsantre asit veya alkali çözeltileri kullanılmadan gerçekleştirilmelidir. yan ürünlerin oluşumu ve mevcut ve yeni oluşan kimyasal bağların yok edilmesi.

Şu anda, bu koşulları karşılayan oligonükleotitlerin sentezi için çok sayıda yöntem geliştirilmiş, uygun koruyucu gruplar seçilmiş ve fosfat grubunu aktive etmeye yönelik yöntemler önerilmiştir.

Genişletilmiş nükleik asit fragmanlarının sentezi çok sayıda aşamadan oluşur. Her kimyasal reaksiyonu gerçekleştirdikten sonra, elde edilen ürünü reaksiyona girmemiş başlangıç malzemelerinden ve diğer safsızlıklardan arındırarak izole etmek gerekir. Bu da süreci uzun ve zahmetli kılmakta ve ayrıca izolasyonun her aşamasında önemli kayıplara yol açmaktadır.

1962'de Amerikalı bilim adamı Robert Merrifield, süreci büyük ölçüde basitleştirmeyi ve hızlandırmayı mümkün kılan orijinal katı faz sentez yöntemi fikrini önerdi. Buradaki fikir, birinci monomerin (nükleosit), bir reaktör kolonuna yerleştirilmiş çözünmez bir polimer taşıyıcıya (katı faz) bağlanmasıdır. İkinci monomeri ve diğer gerekli reaktifleri içeren bir çözelti kolondan geçirilir. Bu durumda, ortaya çıkan reaksiyon ürününün de katı faza bağlı olduğu ortaya çıkar. Kolon daha sonra reaksiyona girmemiş maddeleri ve yan ürünleri uzaklaştırmak için çözücü ile yıkanır, ardından bir sonraki monomer reaktörden geçirilir ve istenen ürünün sentezi tamamlanana kadar prosedür birçok kez tekrarlanır. Böylece büyüyen polimer zinciri sentez sırasında katı faza sabitlenir ve çözeltideki diğer bileşenlerle tüm reaksiyonlar destek yüzeyinde ilerler. Bu teknik, ara ürünleri ayırma ve saflaştırmaya yönelik karmaşık ve zaman alan prosedürlerin yerine basit polimer yıkama işlemlerinin geçmesini mümkün kılar.

Sentez birkaç temel adımı içerir.

Aşama 1. Bir oligonükleotit zinciri oluşturmak için başlangıç blokları olan korumalı monomerlerin elde edilmesi. Bunu yapmak için, kimyasal dönüşümlere uğramaması gereken molekül parçaları, özel koruyucu gruplar tarafından bloke edilir.

Adım 2: Terminal monomerin (korumalı nükleosit) polimer taşıyıcıya bağlanması. Bağlı terminal monomere sahip taşıyıcı granüller, reaktör kolonuna verilir.

Adım 3: Terminal monomerin korumasının kaldırılması. Bunu yapmak için, koruyucu grubun ortadan kaldırılmasına neden olan bir reaktif çözeltisi kolondan geçirilir.

Aşama 4. Aktifleştirici bir reaktif ile karıştırılmış ikinci monomer çözeltisinin kolondan geçirildiği yoğunlaştırma.

Adım 3 ve 4, gerekli uzunlukta bir biyopolimer elde edilene kadar birçok kez tekrarlanır. Daha sonra 5. ve 6. adımlar gerçekleştirilir.

Aşama 5. Sentezlenen ürünün katı fazdan ayrılmasına ve tüm koruyucu grupların çıkarılmasına yol açan reaktiflerle desteğin işlenmesi.

Aşama 6. Sentezlenen nükleik asit fragmanının çeşitli kromatografik ve elektroforetik yöntemler kullanılarak izolasyonu ve saflaştırılması. (Reaksiyonların tam olmaması nedeniyle, sentezin sonuna doğru destek üzerinde daha kısa zincirli fragmanlar birikir, bu nedenle nihai ürünün tamamen saflaştırılması gerekir).

Oligonükleotit sentezinin gelişimine ana katkı, 60'ların başında belirli bir dizinin nükleik asit parçalarının kimyasal sentezini gerçekleştiren ve bu çalışma için 1968'de Nobel Ödülü alan G. Korana tarafından yapıldı. 1970 yılında, ilk olarak tam alanin transfer RNA genini sentezledi.

1975'te R. Letsinger, 80'lerin başında M. Carruthers'ın oligonükleotitlerin sentezi için sözde katı faz amidofosfit veya fosforamidit yöntemini geliştirdiği temelinde, bir nükleotidler arası bağ oluşumu için yeni bir yöntem önerdi. O zamandan beri bu yöntemin hızlı gelişimi ve otomasyonu başladı.

Bir oligonükleotidin sentezi için ilk yapı taşları, modifiye edilmiş deoksiribonükleositlerdir (amidofosfitler veya fosforamiditler). Üç değerli fosfor içeren bu bileşikler, beş değerli fosfor türevlerine göre daha aktiftir (Şekil 31).

Amidofosfit monomerleri, korunmuş nükleositlerden türetilir. Modifikasyon, deoksiadenozin ve deoksisidin amino gruplarına bir benzen grubunun ve deoksiguanozinin amino grubuna bir izobütiral grubun bağlanmasından oluşur. Bir amino grubundan yoksun olan timidin değiştirilmez. Bu modifikasyon, nükleositleri istenmeyen yan etkilerden korumak için gereklidir.

Pirinç. 31. Fosforamiditin yapısal formülü

Dört bazın - A, T, G ve C - bu tür türevleri, DNA'nın kimyasal sentezi için kullanılır.

DMT - dimetoksitritil

Ben - metil grubu

Sentez katı fazda gerçekleştirilir, büyüyen DNA zinciri katı bir taşıyıcı üzerine sabitlenir, bu da tüm reaksiyonları tek bir kapta gerçekleştirmeyi, her aşamadan sonra gereksiz reaktifleri kolayca yıkamayı ve optimum miktarda yenilerini eklemeyi mümkün kılar. tam reaksiyon. İlk nükleosid, katı bir desteğe kimyasal olarak sabitlenir. ayırıcı(Şekil 32). Bunlar genellikle gözenekleri aynı boyutta olan gözenekli cam boncuklardır.

Pirinç. 32. Bir ayırıcı ile sabitlenen ilk nükleosid.

Sentez şemasına göre gerçekleştirilen n döngüden sonra (Şekil 33), n + 1 nükleotitten tek sarmallı bir DNA fragmanı oluşur.

Pirinç. 33. Bir oligonükleotidin kimyasal sentez şeması

Döngü, ilk nükleositin cam küreye bağlanmasından sonra başlar.

Susuz bir çözücü (asetonitril) ile yıkanır, kalıntıları argon ile temizlenerek çıkarılır.

DMT'yi (detritilasyon) çıkarmak için TCA (trikloroasetik asit) ile yıkandı

Tekrar solvent ve TCA ile yıkanır, argon ile temizlenir ve bu aşamada fosforamiditi aktive eden fosforimidit ve tetrazol formundaki bir sonraki nükleosid eklenir, bağlanmamış reaktifler argon ile temizlenerek uzaklaştırılır.

Birinci adımın sonunda desteklenen nükleositlerin tamamı fosforamidite bağlı olmadığından, ikinci adımda eklenen nükleosid ile etkileşimlerini önlemek gerekir. Bunu yapmak için, reaksiyona girmemiş 5'-OH grubu, asetik anhidrit ve dimetilaminopiridin (başlık) ile asetillenir.

İkinci adımda nükleotidler arasında oluşan kararsız fosfit tryter bağı, bir iyot karışımı ile beş değerli bir fosfat tryster'a oksitlenir.

Tarif edilen tüm işlemler, programa uygun olarak yetiştirme zincirine son nükleosid eklenene kadar gerçekleştirilir.

Metil grupları doğrudan reaksiyon kolonunda kimyasal işlemle uzaklaştırılır. Daha sonra oligonükleotidler, 3'-OH ucu ile birlikte ayırıcı molekülden ayrılır ve kolondan ayrıştırılır; daha sonra benzoil, izobütiral ve DMT grupları sırayla çıkarılır. Zincirin 5' ucu enzimatik (polinükleotit kinaz + ATP) veya kimyasal yöntemle fosforile edilir.

Katı faz sentez yönteminin önemli bir avantajı, işlemlerin basitliğidir. Sentez işlemi, korunan monomerlerin, reaktiflerin ve çözücülerin, büyüyen bir zincirin bağlı olduğu bir polimer taşıyıcılı bir kolondan geçirilmesinin tekrarlanan adımlarından oluşur. Bu, süreci otomatikleştirmeyi mümkün kılar.

Otomatik sentezleyiciler, kendisine bağlı bir birinci monomere sahip bir taşıyıcı içeren bir reaktörü ve gerekli monomerleri, reaktifleri ve çözücüleri içeren kapları içerir. Bir pompa yardımıyla, bu kaplardan gelen çözeltiler, mevcut programa ve sentezlenen protein veya nükleik asit fragmanının verilen sırasına göre dönüşümlü olarak reaktöre beslenir. Şu anda, peptitlerin ve oligonükleotitlerin otomatik sentezleyicileri, yerli olanlar da dahil olmak üzere çeşitli şirketler tarafından üretilmektedir.

DNA dizilimi

Bir DNA molekülü hakkında kapsamlı bilgi ancak onun nükleotid dizisinin belirlenmesi ile elde edilebilir. Bu prosedür denir sıralama(İngilizceden. sekans). Böylece, geni dizileyerek, yani. DNA'nın belirli bir bölümünün nükleotit dizisini belirledikten sonra, bu nükleotid dizisini işlevi zaten bilinen genlerinkilerle karşılaştırarak işlevini belirlemek genellikle mümkündür. Nükleotit dizisi hakkında veri olmadan, moleküler klonlama ve rekombinant DNA ifadesinin oluşturulması üzerine araştırma yapmak imkansızdır.

DNA dizileme oldukça pahalıdır. Özel hassas ekipman, ultra saf kimyasallar ve biyolojik müstahzarların yanı sıra yüksek düzeyde eğitimli uzmanlar gerektirirler. Biyoteknolojinin potansiyeli ancak araçları (genom dizileme dahil) kişisel bilgisayarlar kadar erişilebilir ve ucuz hale geldiğinde tam olarak anlaşılacaktır. Dizileme prosedürünün maliyetini azaltmak için, yeni yöntemlerin geliştiricileri hazırlık adımlarının sayısını azaltmaya, ekipmanı sınıra kadar küçültmeye ve milyonlarca molekülü aynı anda sıralamaya çalışıyor.

Dizileme yöntemlerinin açıklamasına geçmeden önce, DNA nükleotid dizilerinin çoğaltılmasının ana noktalarını, yani; DNA replikasyonunun bazı temel adımları.

Bölünmeye başlayan bir hücrenin DNA'sı önemli değişikliklere uğrar: çift sarmal gevşer, zincirler birbirinden uzaklaşır. Her zincirde, tamamlayıcı polinükleotitlerin sentezi, birinde - sürekli, ikincisinde - süreksiz olarak başlar. DNA'ya bağımlı DNA polimeraz adı verilen bir enzim tarafından katalize edilir; başka bir enzim olan DNA ligaz, polinükleotit fragmanlarını sürekli bir zincire bağlar. Böylece bir DNA molekülünden iki tane oluşur.

Birçok DNA dizileme yöntemi, bu molekülün zincirlerinin birbirini tamamlamasına dayanır. Genetik alfabe sadece dört harften oluşur - adenin (A), sitozin (C), guanin (G) ve timinin (T) azotlu bazları. DNA molekülünün zıt ipliklerinin bazları, tamamlayıcılık kuralına göre bağlanır: A, T ile bir çift oluşturur ve C, G ile bir çift oluşturur. Bu etkileşimin bir sonucu olarak, iyi bilinen çift sarmal oluşur - a döner merdiveni andıran yapı (Res. 34).

Pirinç. 34. Her iki DNA zincirinde yavru nükleotit zincirlerinin sentezi için şema

Canlı organizmalar, genetik materyallerini kopyalamak (replikasyon) ve onarılan hasarı onarmak (onarım) için tamamlayıcılık ilkesini kullanır. Ayrıca, hedef DNA fragmanlarının amplifikasyonunun (PCR'ye bakın) ve 1970'lerin sonunda geliştirilen bir yöntem kullanılarak sonraki dizilemelerinin temelini oluşturur. Sanger.